Sampel Laporan Lab Biologi Tentang Telur Starfish

GST-SH2 domain protein fusi plcgamma untuk menganalisis protein yang mengikat domain sh2 fosfolipase c gamma selama pemupukan telur dalam Telur Starfish (Asterina Miniata).

pengantar

Starfish adalah invertebrata yang tinggal di bawah. Starfish mereproduksi dengan pemijahan dan pemupukan eksternal. Dengan demikian mereka menghasilkan larva hidup bebas. Oocytes ini berkembang pada tahap awal meiosis. Di Starfish, Polyspermy dicegah dengan telur dengan menciptakan gelombang kejut. Pemupukan adalah proses fusi gamet pria dan wanita untuk menghasilkan keturunan mereka. Selama pemupukan, sperma memicu serangkaian kegiatan yang mengakibatkan aktivasi mitosis dan pengembangan. Proses-proses ini memungkinkan fusi dan perkembangan embrio dengan gen dari sperma. Peningkatan tingkat kalsium pada sitoplasma telur adalah dasar untuk pemupukan. Selama pemupukan telur, PLC-gamma diaktifkan oleh domain SH2, yang pada gilirannya merangsang produksi Insp3, yang meningkatkan rilis CA2 + intraseluler. Setelah menerima sinyal kalsium, transiam kalsium, telur dipindahkan melalui titik kontrol mitosis dari siklus sel. Produksi Insp3 memulai siklus sel mitosis pertama dari telur yang dibuahi. Siklus sel telur dihentikan sampai dibuahi pada G1 mitosis pertama di bintang laut. Sel kemudian memasuki anafase dan mereka menyelesaikan meiosis dan akhirnya memungkinkan bintang laut untuk menjalani sintesis DNA. Dengan demikian inisiasi pemupukan adalah dengan aktivasi PLC. Ada banyak isoform PLC. Mereka beta, gamma, dan delta. Gamma PLC diaktifkan oleh protein Tyrosine Kinases (PTK).

Material dan metode

1. Persiapan sampel: oosit, telur, zigot, dan jaringan diperoleh.
2. Telur bintang laut kemudian liked menggunakan buffer lisis untuk memisahkan protein dari organel sel. Buffer lisis terdiri dari 20 mm hepes, pH 7.0, 150 mm NaCl, 10 mm na3vo4, 10 mm NAF, 1% NP-40, 1 mm EDTA, 100 mm naglycerophosphate, 1x protease inhibitor koktail
3. Uji protein: Telur Lysed diencerkan dalam buffer SD 1% (1% SD dalam air), dan absorbansi dibaca pada 562 nm.
4. Elektroforesis Gel Poliakrilamida: Sampel yang diencerkan kemudian disepuh pada 10% akrilamida-bisakrilamida dengan konsentrasi gel susun 5%. Elektroforesis dilakukan pada 70- 150 V sampai pemisahannya jelas.
5. Western Blotting: Setelah elektroforesis berakhir, gel diambil dari tangki, dan gel pemisah halaman yang berisi sampel protein ditransfer ke membran nitroselulosa menggunakan teknik blotting barat. Transfer protein dilakukan pada jam 1000mA.
6. Membran yang berisi protein disimpan dengan pelabelan yang tepat.
7. Blot antibodi: Blot membran diambil dan disimpan di blotto. Antibodi diinkubasi, dan noda dikembangkan.
8. Interaksi afinitas dengan protein fusi GST: Protein Fusion GST diambil di PBS. Protein lisat dikeluarkan dari freezer dan dilarutkan dalam buffer. Protein itu kemudian sepenuhnya dilarutkan dan berputar, dan pelet dihilangkan, dan lisat terlarut dipisahkan, dan uji protein dilakukan.
9. ASSAY PROTEIN: Ke 2 L lisat 798 L air adalah air ditambahkan, dan 200l Reagen Bradford dicampur, dan hasilnya diamati pada 595nm. Akhirnya ke dalam campuran, manik-manik Fusion GST ditambahkan dan diinkubasi selama 1 jam di 4oC dengan goyang. Manik-manik itu kemudian dipisahkan, dan kemudian supernatan diselamatkan sebagai tidak terikat. Protein terikat longgar dihilangkan dengan membilasnya dalam buffer TBS 5x 1ml. 20l buffer sampel gel protein akhirnya ditambahkan ke manik-manik.

10. Manik-manik dengan protein kemudian dijalankan dalam elektroforesis, dan hasilnya diamati.

Hasil dan Diskusi

Gambar 1:

LANE 1: Penanda protein.
Lane 2: PLCG-SH2 protein yang tidak terikat
Lane 3: Protein GST UNLOCK
Lane 4: Protein GST Bound
lane5: protein yang tidak terikat
Lane 6: protein terikat plcg-sh2

Lane 2 menunjukkan bahwa protein tak terikat PLCG-SH2 dipisahkan dan bergerak ke bawah gel. Lane 3 menunjukkan bahwa protein GST juga dipisahkan dan bergerak ke bawah. Lane 4 berisi protein GST terikat dengan dua band yang berbeda. Protein terikat PLCG-SH2 di Lane 6 lebih gelap dan lebih berbeda. Ini menunjukkan bahwa mereka terikat dengan GST.

Gambar 2:

Lane 1: penanda protein (penanda berat molekul prestasi)
Lane2: F8 plcg-sh2 terikat protein
Lane 3: Protein terikat F8 GST
Lane 4: Protein terikat PLCG-SH2 yang tidak dibuahi
Lane 5: Protein terikat GST yang tidak dibuahi
Lane 6: F8 plcg-sh2 protein tak terikat
Jalur 7: F8 GST protein yang tidak terikat
Lane 8: protein tak terikat PLCG-SH2 yang tidak dibuahi
Lane 9: Protein GST UNLTEGILED
Lane 10: spidol protein (penanda berat molekul prestasi) ...